Пид знания и Догмы. Условия для возникновения и упадка научных теорий icon

Пид знания и Догмы. Условия для возникновения и упадка научных теорий


Скачать 31.78 Kb.
НазваниеПид знания и Догмы. Условия для возникновения и упадка научных теорий
Размер31.78 Kb.
ТипДокументы

CПИД - Знания и Догмы.

Условия для возникновения и упадка научных теорий.

Конгресс от 16 июля / 17 2010, Вена, Австрия

Надежность ПЦР для выявления генетических последовательностей ВИЧ

Хуан Мануэль Веласкес Morillo

Теоретическая часть

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - является лабораторной методикой, которая используется для обнаружения генетических последовательностей, полученных из микроорганизмов или генов человека, что позволяет ее использование в микробиологической и генетической диагностике. Последние 15 лет постоянно растет популярность ПЦР в борьбе с ВИЧ / СПИДом . А именно, в измерении вирусной нагрузки, как способе вычисления количества копий РНК ВИЧ в плазме крови человека, а так же для определения собственно ДНК ВИЧ (провирусной ДНК) в клетках человека.

Однако, уже на данный момент существует ряд исследований, указывающих на низкую специфичность данной методики.

Одной из причин этого может быть высокое генетическое разнообразие ВИЧ, а так же наличие эндогенных ретровирусных последовательностей в геномах человеческих образцов.

Поэтому возникла необходимость в проверке надежности тех, методик определения последовательностей, которые обычно используются в коммерческих тестах, а также в проверке гипотезы о том, что генетические последовательностей рассматриваемые как ВИЧ, могут быть заранее представлены эндогенным генетическим материалом.


Что такое ПЦР?

Полимеразная цепная реакции (ПЦР) представляет собой молекулярную методику, которая позволяет получить несколько копий с определенного (специфического) фрагмента микробной или человеческой ДНК в целях выявления наличия конкретного микроорганизма (в случае микробиологической диагностики), или изменения в естественной последовательности человеческого генома (в случае генетических патологий, например, таких как кистозный фиброз).

Методика ПЦР выполняется полностью в пробирке. Для постановки диагноза, необходимым условием является заранее заданная последовательность генома микроорганизма или нормальная последовательность с определенного участка человеческого генома. В ходе методики выбирают определенную уникальную последовательность нуклеотидов, которая не сможет перекрестно реагировать с другими последовательностями из геномов других микроорганизмов или генов человека.

В настоящее время существует несколько биоинформационных инструментов для выполнения этой задачи (например, LAST) из нескольких доступных (коммерческих) баз данных генетического материала (например, GenBank).

Как только исследователь выбирает целевой участок он / она конструируют два коротких фрагмента

ДНК (олигонуклеотида), которые имеют дополнительное азотистое основание на обоих концах. Эти олигонуклеотиды называются праймерами, и они являются ключевыми в последующей химической реакции.

Остальные химические вещества, используемые в методике, в целом схожи для любой диагностики, независимо от искомой последовательности и его источника организма (микроорганизма или человека).

В ПЦР используются следующие ингридиены:

- шаблон ДНК: в случае медицинского диагноза,

это ДНК из образца, т.е. полученная из

биологических жидкостей или тканей;

происхождение образца может быть из

микробиологического или человеческого

материала

- нуклеотиды: основные структурные элементы

молекулы ДНК. Известно четыре типа азотистых

основания: ddATP ( аденин), ddGTP (гуанин), ddTTP

(timidine), ddCTP (citosine).

- ДНК-полимеразы: ферменты, участвующие в

репликации ДНК.

Репликация – это процесс синтеза дочерней

молекулы на основе однонитиевой матрицы ДНК.

В данном случае, по принципу

взаимодополняемости, праймер связывается с с

конкретным участком однонитиевой ДНК, с

последующим последовательным

присоединением новых нуклеотидов по ходу нити

ДНК. Это "мотор" ПЦР.

Как правило, все химические вещества смешиваются в водной среде с учетом рН.

Вся процедура зависит от последовательной смены температурных режимов. Так, когда смесь нагревают до 95 º C, шаблонные двухцепочечные ДНК подвергаются денатурации. Т.е., цепочки расправляются и разделяются. После чего, температура понижается до 55-60 º С, что позволяет праймерам присоединиться к определенному участку ДНК по принципу комплементарности. Этот этап ПЦР называется отжигом.

Когда на следующем шаге, температура повышается до 72 ° С, полимераза активизируется и начинает производство новых копий. Описанные выше три шага называется циклом, а сама процедура ПЦР обычно состоит из 30-40 циклов. Это процесс выполняется автоматически в так называемом амплификаторе.

Далее, полученный конечный продукт ПЦР должен быть идентифицирован. Самым простым способом визуализировать результаты ПЦР является метод электрофореза. Он представляет собой миграцию с различной скоростью фрагментов ДНК в специальном – агарозном, геле посредством силы электрического поля.

Внутренняя структура геля представляет собой сетку, и молекулы ДНК двигаются от катода к аноду. Крупные молекулы несколько медленнее, фрагменты имеющие меньший молекулярный вес быстрее. Образцы окрашивают специальными красителями, обычно бромидом этидия, что позволяет визуализировать локализацию молекул с соизмеримыми размерами.

Таким образом, можно реально сказать, существует ли выбранная последовательность в анализируемом образце.

Теоретически, по итогам ПЦР, мы только должны были бы увидеть лишь одну полосу ДНК в геле, соответствующую заданному шаблону. Однако, зачастую можно обнаружить несколько полос в следующих случаях:

- Слишком низкая температура отжига праймеров:

в таком случае, праймеры могут связываться с

другими участками шаблона ДНК, с не совсем

комплементарными последовательностями.

Таким образом, ПЦР очень чувствителен к небольшим изменениям в температуре и химическом

составе среды. К тому же, амплификаторы различных торговых марок могут требовать температурной и средовой коррекции.

- Наличие неизвестных последовательностей в

исследуемом образце: хотя большое количество

генетических последовательностей в настоящее

время известны и зарегистрированы, и они есть в

свободном доступе в базах данных, существует и

огромное количество неизвестных

микроорганизмов, или их мутировавших штаммов,

что вносит серьезный элемент ненадежности во всю

методику.

Кроме того, в образце существует множество последовательностей, полученных из РНК (рибонуклеиновая кислота), образующихся при естественных клеточных функциях, которые так же, могут перекрестно реагировать с праймерами

и давать неспецифические полосы.

В практической области применения, ПЦР является более естественным и надежным, когда образцы человеческих последовательностей используют для

генетической диагностики, нежели тогда, когда она используется для микробиологических исследований. В этом случае, просто вариации в последовательности микроорганизмов могут привести к необнаружению искомых последовательностей (ложный отрицательный результат), либо привязки к последовательностям других, близко- родственных микроорганизмов (ложный положительный результат).

В последние годы появилось несколько подходов к повышению надежности выявления специфических

последовательностей, которые были зарегистрированы и расширили сферу применимости ПЦР в клинических диагностиках.

Тем не менее, стандартизированные коммерческие наборы ПЦР для микробиологического тестирования должны быть рекомендованы с осторожностью, приняв во внимание факт ненадежности и не полагаться в установке диагноза исключительно по результатам ПЦР.


ПЦР и ВИЧ

Для диагностики на ВИЧ, ПЦР была введена в начале 1990-х годов, главным образом потому, что тестирование на антитела к ВИЧ могут давать не совсем надежные результаты, к тому же, далеко не на ранней стадии инфицирования (согласно официальной теории). Тогда в исследованиях ПЦР использовалась для обнаружения РНК - исходной молекулы внутри вируса ВИЧ, а так же ДНК, полученной на основе обратной транскрипции РНК, непосредственно из клеток человека.

Также, для пациентов ВИЧ/СПИД в середине 1990-х годов было введено, измерение вирусной нагрузки. Для этого определяют количество копий РНК ВИЧ в плазме крови.

Согласно официальной теории, по данному результату выстраивается прогноз прогрессирования заболевания.

В дальнейшем было разработано несколько методик для определения вирусных частиц, однако, основной, по сей день, является, так называемая, методика RT-PCR (методика ПЦР с обратной транскрипцией). Обратная транскрипция это естественный процесс, который подразумевает синтез ДНК на матрице РНК, осуществляемый с помощью фермента - обратной транскриптазы.

Сорок лет назад, исследователи полагали, что этот фермент присутствует только в ретровирусах, однако, в настоящее время, стало известно, что многие организмы имеют обратные транскриптазы, хотя их функции пока не достаточно прояснены.

ДНК, получаемая на основе РНК, в данной модификации ПЦР, применяется для окончательного количественного определения копий вирусных частиц. Как правило, их получают с помощью

меченых фрагментов ДНК. В дальнейшем меченый участок ДНК может быть использован для идентификации по цветовой реакции, причем, таким образом, что интенсивность цвета будет пропорциональная количеству конечного продукта. Хотя эта процедура используется уже более чем 10 лет, она обладает низкой точностью, потому что существует ряд факторов, влияющих на выход реакции ПЦР.

В настоящее же время наиболее популярна такая разновидность ПЦР, как ^ ПЦР в реальном времени. Эта техника включает более четкий контроль за факторами, влияющими на основной процесс, а конечные продукты могут быть обнаружены не в конце, а в каждом цикле реакции.

Это делает исследование более надежным, однако и здесь были описаны некоторые расхождения итоговых значений, в зависимости от выбранной эталонной последовательности ВИЧ, а так же от того, какой коммерческой фирмы – производителя выбран комплект для ПЦР. Такая ситуация складывается, например, в случае известных, конкурирующих между собой, производителей, таких как, Roche и Abbott, широко представленных на современном рынке.

Все эти годы огромное генетическое разнообразие ВИЧ-вирусной инфекции считалось препятствием на пути стандартизация ПЦР.

В лабораторных отчетах 1998 года одной из главной испанской больницы, которую посещают пациенты ВИЧ / СПИД, найдено около 20% ложноположительных результатов ПЦР. В это время

они использовали комплект Roche с праймерами, предназначенными для обнаружения большого количества генетических подтипов ВИЧ.

Такие результаты говорят о явном несоответствии ПЦР с существующему многообразию последовательностей ДНК ВИЧ.

Обнаружение ДНК ВИЧ используют и для изучения латентной (спящей) инфекции клеток человека.

Несколько практических работ, опубликованных за последние 15 лет, сообщают противоречивые данные о результатах серологических методов диагностики ПЦР ДНК, о ложно-отрицательных и ложно-положительных результатах, которые были пояснены генетическим разнообразием ВИЧ-инфекции, но на самом деле они могут отражать другие факты, которые мы приводим в следующем разделе.

^ Существуют ли ВИЧ- последовательности эндогенного происхождения?

Когда впервые был описан ВИЧ практически, никто ничего не знал о существовании эндогенных ретровирусах человека, хотя у животных они были уже известны . На основании не очень хорошо спланированных эпидемиологических

опросов, большинство исследователей пришли к выводу о существовании ВИЧ только экзогенного происхождения. Однако, с 1990-х, и, особенно,

с 2001 года, когда впервые был опубликован проект человеческого генома, научному сообществу стало известно, что 8-10% генома человека состоит из, так называемых, эндогенных последовательностей ретровирусного происхождения. Сначала ученые предположили, что эти последовательности были наследием эволюции, доставшихся от ископаемых предков.

Тогда они утверждали, что найденные ретровирусные последовательности не способны дать зрелые вирусных частицы, однако, в настоящее время, стали известными некоторые семейства эндогенных ретровирусов, которые вполне способны к продуцированию жизнеспособных вирусных частиц с инфекционным способностями.

Кроме того, в настоящее время мы знаем, что эти последовательности действуют в период внутриутробного развития, участвуют в процессе

формирования плаценты, и, возможно, влияют на временные иммуносупрессии у беременных

женщин.

Некоторые ученые с уверенностью говорят, что эти частицы могут персистировать в межклеточном пространстве, и участвуют в адаптивных процессах во время различных стрессовых ситуаций.

В 1992 году в литературе было отмечено, что обнаружены некоторые эндогенные последовательности, сходные с последовательностями ВИЧ у больных раком простаты и молочной железы, а так же, последние были обнаружены и у их родственников.

В последние же годы, в процессе исследования вирусной нагрузки у больных ВИЧ / СПИДом, описаны некоторые эндогенные ретровирусы из семейств отличных от ВИЧ, которые, однако, не были обнаружены у здоровых субъектов.

Одной из особенностей эндогенных последовательностей является их передача в составе хромосом от родителей к детям, наряду с другими обычными человеческими генами. И, если это так, то ДНК этих последовательностей должна быть

представлена у одного или обоих родителей ВИЧ-положительных родителей. Согласно нашей гипотезе, только тогда, когда происходят некие стрессовые события, эти последовательности могут быть активизированы, и, тогда они могут быть обнаружены в исследовании на вирусную нагрузку. Это означает, что РНК транслирует информацию о белках, которые формируют вирусные частицы, и их последующие биологические функции. Наша же иммунная система начинает производство антител против них для того, чтобы ограничить и контролировать их деятельность.

Таким образом, только те лица, которые были изначально носителями этих последовательностей

могут быть ВИЧ +, особенно, если произошла какая либо активизация этих последовательность в таких стрессовых условиях, как наркомания, бактериальное инфицирование, различные травмы во время анального сношения, или при попадании донорской крови во время переливания.

Как уже отмечалось ранее, если эта гипотеза верна, ПЦР на ДНК ВИЧ должна быть положительной только в одном случае, когда у одного или обоих родителей пациента отмечено наличие ВИЧ.

В данной работе мы предоставили результаты следующих исследований.

Мы использовали образцы, принадлежащие нескольким ВИЧ+ людей, совместно с их ныне живущими обоими родителями, а, так же братом и дочерью. В данном случае для определения последовательности ДНК ВИЧ применялась ПЦР, с праймером последовательностей, из ранее известных коммерческих наборов, таких как Roche, или Abbott, с учетом самостоятельной подготовки химических реагентов с целью контроля побочных эффектов реакции.

Электрофорез в агарозе сравнительно неплохая процедура для визуализации продуктов ПЦР, но только одного конкретного члена группы или несколько человек той же группы. Но решающее значение имеет шаг секвенирования ДНК, для подтверждения, того, что секвенируемый продукт относится к ранее описанным ВИЧ-последовательностям. Если это так, то, возможно, у ВИЧ-позитивных лиц, результаты процедуры будут аналогичны с результатами образцов их родственников.

В ключе данной гипотезы, нами было проведено следующее пилотное исследование, с помощью праймеров, применяемых для ПЦР в реальном времени, с использованием коммерческих наборов

Abbott в тех условиях, которые соответствовали таковым в ранее опубликованных работах и патентах. Мы брали образцы ВИЧ-положительной женщины и ее ВИЧ-положительной матери. В обоих случаях, используя различные профили температуры, мы получили много электрофоретических групп, в связи с чем стало действительно невозможным сделать какой либо вывод, о том, что мы на самом деле амплифицировали. Хотя проведенный нами эксперимент ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЙ и мы не можем извлечь окончательные выводы, мы с уверенностью можем подозревать, что чрезвычайно трудно считать надежными полученные результаты ПЦР, которые обычно и получаются в ходе использования коммерческих наборов. Если провести более исчерпывающиеся исследования в улучшенных условиях ПЦР (без учета количественных показателей, а только для определения последовательности ДНК) возможно дадут результаты, которые докажут гипотезу о эндогенном происхождении тех последовательностей ВИЧ, которые ранее считались экзогенными.


Хуан Мануэль Веласкес Morillo

- бакалавр в области стоматологии, 1994

- PhD, 2002

- несколько курсов для аспирантов по молекулярной

диагностике, ВИЧ / СПИД и наркомании.

- Исследовательский опыт применения ПЦР для

Микробиологической и генетической диагностике,

несколькими статей, опубликованных в

международных рецензируемых журналах.

- Клинический опыт применения диагноза

ВИЧ + с 1997 года, в первую очередь в соответствии с


официальной теории о ВИЧ / СПИДе, но с точки

зрения ближе к диссидентской позиции с 2004 года.

Похожие:

Пид знания и Догмы. Условия для возникновения и упадка научных теорий iconПид знания и Догмы. Условия для возникновения и упадка научных теорий
Последние 15 лет постоянно растет популярность пцр в борьбе с вич / спидом. А именно, в измерении вирусной нагрузки, как способе...
Пид знания и Догмы. Условия для возникновения и упадка научных теорий iconТеория организации как область научных знаний и учебная дисциплина, ее место в системе научных знании
То- наука, изучающая принципы, законы и закономерности возникновения орг., как явления, ее эволюции., механизмы функционирования,...
Пид знания и Догмы. Условия для возникновения и упадка научных теорий iconТеория организации как область научных знаний и учебная дисциплина, ее место в системе научных знании
То- наука, изучающая принципы, законы и закономерности возникновения орг., как явления, ее эволюции., механизмы функционирования,...
Пид знания и Догмы. Условия для возникновения и упадка научных теорий iconЧеловек как результат биологической и социальной эволюции
За все это время, было создано множество теорий объясняющих происхождение, объединенных в общую отрасль науки и исследований – антропогенез...
Пид знания и Догмы. Условия для возникновения и упадка научных теорий iconВ. В. Козлов этюды о трансперсональной парадигме психологии
В начале 90-х годов мы заявили, что интенсивные интегративные психотехнологии придерживаются голономной парадигмы построения науки,...
Пид знания и Догмы. Условия для возникновения и упадка научных теорий iconДоктор Ричард Гербер приводит обширную, тща­тельно подобранную информацию о тонкоэнергетичес­кой анатомии человека Эта книга
Кроме того, я ре­комендовала бы эту книгу и в качестве справочника для научных работников, и как пособие для непрофес­сионалов, желающих...
Пид знания и Догмы. Условия для возникновения и упадка научных теорий iconФормульная Йога Улыбки. Базисный курс. Комплексы спиральных движений, которые будут рассмотрены на семинар
Профессор Пак Чже Ву – выдающийся ученый в области медицины и акупунктуры, создатель многих научных теорий и методов, таких как Су...
Пид знания и Догмы. Условия для возникновения и упадка научных теорий iconЛекции по введению в психотерапию для врачей, психологов и учителей
Адлер и его последователи изучали условия возникновения у человека комплекса неполноценности и средств компенсации подлинных и мнимых...
Пид знания и Догмы. Условия для возникновения и упадка научных теорий iconЛитература Хрестоматия по методике преподавания биологии: учеб пособие для студентов пед ин-тов по биол спец / Сост. И. Д. Карцева, Л. С. Шубкина. М.: Просвещение, 1984
Условия возникновения методики преподавания биологии как науки. «Устав народных училищ в Российской империи» 1786г
Пид знания и Догмы. Условия для возникновения и упадка научных теорий iconЮ. Б. Рагер 2013
...
Пид знания и Догмы. Условия для возникновения и упадка научных теорий iconИнформация для авторов статей для сборника научных статей «Мировое сообщество: проблемы и пути решения»
В данном междисциплинарном сборнике научных статей публикуются материалы, охватывающие исследования в различных областях современной...
Вы можете разместить ссылку на наш сайт:
Документы


При копировании материала укажите ссылку ©ignorik.ru 2015

контакты
Документы